冰凍片常采用液氮法制備做法

冰凍片常采用液氮法制備，具體做法如下：

1.包埋 切片

將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。取出組織，預(yù)冷PBS清洗后平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（比如用鋁箔紙折成有口的方盒），加入適量OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。

2.固定

在冰凍切片機(jī)上切片，完成后用預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定20-30min，冷水清洗3-5次，-20度保存。

3.冰凍切片機(jī)切片，厚度3-5微米

4.切片后固定

將切好的冰凍片用預(yù)冷的組織固定液固定30min，蒸餾水洗3-5次，洗干凈固定液，自然晾干后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20℃保存

冰凍片免yi 熒光實(shí)驗(yàn)步驟

熱修復(fù)抗原:將切片浸入修復(fù)緩沖液（檸檬酸鹽或EDTA修復(fù)液）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10 min后，反復(fù)1-2 次。室溫自然冷卻后水洗一次

滴加封閉液（5%BSA或二抗同源血清）, 37℃孵育30 分鐘。甩去多余液體, 不洗。

滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過夜后37℃復(fù)溫30min，也可37 ℃ 孵育2 h。PBS洗5min×3 次。

滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG)，37℃ 30 min。PBS洗5min×3 次。

滴加試劑SABC-FITC，37℃ 孵育30 min。PBS洗5 min×4 次。

DAPI復(fù)染2-3min，充分水洗，封片觀察。