操作要點(diǎn)：
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
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產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
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兔腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 |
詳見說明書 |
FS-016500 |
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
主要功能：
（1）血管平滑肌細(xì)胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。
（2）表達(dá)鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應(yīng)。
（3）與血管的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)。
生理變化：
（1）主動(dòng)脈硬化。
（2）主動(dòng)脈瘤
（3）主動(dòng)脈鈣化。
基本特性：
（1）組織來源于正常大鼠大動(dòng)脈組織。
（2）鑒定：肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。
（3）原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存。
（4）每凍存管細(xì)胞數(shù)：>5×105 cells/1ml。
（5）肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗(yàn)證。
（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。
培養(yǎng)步驟：
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
PA-GFP（PAGFP） D-海藻糖
人鳥苷酸結(jié)合蛋白4(Gbp4)ELISA Kit 超敏型BCA法蛋白定量試劑盒
MS751細(xì)胞株 pVP33K
PinPoint Xa-2(PinPointXa2)（60908-4236） Tris-HEPES-SDS Running Buffer,10X
地塞米松 人干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子(ITAC/CXCL11)ELISA Kit
SuperTOPO-Amp通用克隆試劑盒（SuperTOPO三劍客） Universal medium for yeasts (ym)
YCp8cat pEYDG1
ECFP 兔子白介素1β (IL-1β)ELISA Kit
人堿成纖維細(xì)胞生長因子4(bFGF-4)ELISA Kit 一步式胞漿蛋白微量制備試劑盒（100次）
枯草桿BS168種 pT7Blue
pGADT7-T (pGADT7T)（60908-3470） MOPSO Buffer,0.2M,pH7.0
6-Benzylaminopurine（6-芐基氨基嘌呤） 人S100鈣結(jié)合蛋白A8/鈣粒蛋白A(S100A8)ELISA Kit
木瓜蛋白酶抑制劑溶液，0.5 mg/mL Prey seawater broth
兔腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞白蠟樹精 英文名稱：Fraxin 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
氧海罌堿 英文名稱：Oxygen glaucine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
桔梗皂苷D 英文名稱：Platycodin D 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
去芹糖桔梗皂苷D 英文名稱：Deapio platycodin D 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
桔梗皂苷D2 英文名稱：Platycodin D2 規(guī)格：：HPLC≥98% 10mg/支 保存：：-20℃，避光
單酰酒石酸 英文名稱：Caftaric acid 規(guī)格：：HPLC≥98% 5mg/支 保存：：-20℃，避光
1，8-二羥基蒽醌、丹蒽醌;1,8-蒽醌 英文名稱：1, 8- two hydroxy anthraquinone, Dan anthraquinone anthraquinone; 1,8- 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
豆寇明 英文名稱：Dou Kouming 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
加蘭他敏 英文名稱：Galanthamine hydrobromide 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光
蒲公英萜乙酯 英文名稱：Taraxerol acetate 規(guī)格：：HPLC≥98%10mg/支 保存：：-20℃，避光
西貝堿苷 英文名稱：Sipeimine glycoside 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光