免 疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)
免 疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié):
1、冰凍切片制備
建議用新鮮組織,否則組織細胞內部結構破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定
切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當保存。
3、血清封閉
為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的,一般10-30min。
4、一抗孵育條件
在免 疫組化反應中重要,包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4℃、室溫、37℃,其中4℃效果佳;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關,一般37℃1-2h,而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復溫45min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件
二抗一般室溫或37℃30min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應。但在免 疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。
6、復染
目的是形成細胞輪廓,從而更好對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。
7、封片
為了長/期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發(fā)現液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗
為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。