MTT實(shí)驗(yàn)注意事項

1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2. 藥wu濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥wu的有效濃度和時間。

3.  時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，*后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是*好的時間點(diǎn)（因?yàn)檫@個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的*明顯）。

4. 培養(yǎng)時間。200 ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的。

5. MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞優(yōu)良數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)jun也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。

6. 理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7. 實(shí)驗(yàn)時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥wu的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥wu。

8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。