分享感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作流程

日期：2024-09-20 07:30
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摘要： 1、在冰上預(yù)冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管.1支用來(lái)轉(zhuǎn)化樣品,1支做pUC18對(duì)照.同時(shí)將NZY+ broth培養(yǎng)基在42°C預(yù)熱. 2、冰上融化感受態(tài)細(xì)胞.融化時(shí)輕輕將細(xì)胞混勻并分裝成100ul/管. 3、每管中加入隨試劑盒提供的4 ml b-ME（巰基乙醇）. 4、溫和轉(zhuǎn)動(dòng)試管,將細(xì)胞在冰上放置10分鐘,每2分鐘溫和轉(zhuǎn)動(dòng)一下. 5、每管細(xì)胞加入0.1–50 ng樣品DNA （或2 ml連接反應(yīng)物）（參見DNA 質(zhì)量與體積說(shuō)明.）用dH2O水按1:10稀釋對(duì)照pUC18 DNA,并取1 ml稀釋的pUC18 DNA加入轉(zhuǎn)化細(xì)胞. 6、...


分享感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作流程：

1、在冰上預(yù)冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管.1支用來(lái)轉(zhuǎn)化樣品,1支做pUC18對(duì)照.同時(shí)將NZY+ broth培養(yǎng)基在42°C預(yù)熱.

2、冰上融化感受態(tài)細(xì)胞.融化時(shí)輕輕將細(xì)胞混勻并分裝成100ul/管.

3、每管中加入隨試劑盒提供的4 ml b-ME（巰基乙醇）.

4、溫和轉(zhuǎn)動(dòng)試管,將細(xì)胞在冰上放置10分鐘,每2分鐘溫和轉(zhuǎn)動(dòng)一下.

5、每管細(xì)胞加入0.1–50 ng樣品DNA （或2 ml連接反應(yīng)物）（參見DNA 質(zhì)量與體積說(shuō)明.）用dH2O水按1:10稀釋對(duì)照pUC18 DNA,并取1 ml稀釋的pUC18 DNA加入轉(zhuǎn)化細(xì)胞.

6、溫和轉(zhuǎn)動(dòng)試管,并在冰上放置30分鐘.

7、試管在42°C水浴熱激30秒.熱激時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率極度重要.

8、試管冰浴2 分鐘.

9、每管加入0.9 ml 預(yù)熱 （42°C） 的NZY+ 肉湯,37°C、225–250 rpm 搖床培養(yǎng)1 小時(shí).

10、取 200 ml轉(zhuǎn)化混和物鋪帶有相應(yīng)篩選的LB瓊脂糖平板（如果進(jìn)行顏色篩選還需加入IPTG和X-gal）.pUC18陽(yáng)性對(duì)照則取5 ml 鋪氨芐青霉素LB瓊脂糖平板.

注意:細(xì)胞經(jīng) 1000 rpm離心 10分鐘會(huì)聚集,應(yīng)將細(xì)胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉湯重懸.如果用于鋪板的細(xì)胞 <100 ml,先將細(xì)胞加入200 ml培養(yǎng)基中,然后用涂布棒鋪板.如果采用100 ml細(xì)胞則可以直接鋪板.傾斜涂布棒并輕輕拍打,盡量減少涂布棒上的細(xì)胞殘留.

11、37°C培養(yǎng)過(guò)夜.顏色篩選請(qǐng)參見以下Blue-White Color Screening的操作指南.

12、pUC18陽(yáng)性對(duì)照預(yù)計(jì)有約250個(gè)克?。?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA）.而樣品DNA的轉(zhuǎn)化效率隨DNA的量和組成（超螺旋或連接產(chǎn)物）有較大差異,大質(zhì)粒和非超螺旋DNA往往得到較少的克隆.