PCR實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置

1．模板變性溫度 

變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過久沒有必要；反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后zui高變性溫度不宜超過95℃。

2．引物退火溫度

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的zui適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 　　其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時(shí)（如0.2μmol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長(zhǎng)時(shí)間退火沒有必要。

 3．引物延伸溫度

溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的zui適溫度。一般取70～75℃，在72℃時(shí)酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá)35～100個(gè)核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長(zhǎng)度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴(kuò)增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對(duì)于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡(jiǎn)便的雙溫循環(huán)是行之有效的。